Diagnostyka molekularna pasożytniczych nicieni glebowych

Gromada nicienie (Nematoda) obejmuje zwierzęta wielokomórkowe o małych rozmiarach oraz prostej budowie morfologicznej i anatomicznej.
Stanowi jedną z najliczniejszych gromad organizmów występujących na ziemi. Dzięki różnym sposobom odżywiania (saprofityzm, drapieżnictwo, pasożytnictwo) nicienie przystosowały się do zasiedlania różnych ekosystemów. Pasożytnicze nicienie glebowe pobierają substancje odżywcze z żywych komórek swoich gospodarzy, co wpływa niekorzystnie na stan fizjologiczny roślin.

Pojawienie się choroby

Najczęstszymi objawami porażenia rośliny przez nicienie są ogólne osłabienie rośliny (tj. zahamowany wzrost, więdnięcie, żółknięcie i opadanie liści, liczne nekrozy w korzeniach, anomalie w całym systemie korzeniowym, wczesne dojrzewanie), a nawet obumieranie. Słaba kondycja roślin prowadzi do zwiększonej  podatności na inne  pasożyty. Dodatkowo, uszkodzenia mechaniczne wynikające z przerwania tkanki okrywającej korzenia (ryzodermy) stają się łatwą drogą do zasiedlania rośliny przez inne patogeny (bakterie, grzyby). Wszystkie te objawy są charakterystyczne dla chorób zwanych nematozami.

Do tradycyjnych zabiegów agrotechnicznych stosowanych w walce z nicieniami zalicza się:

• płodozmian (tylko w przypadku nicieni o wąskim zakresie gospodarzy);
• utrzymanie gleby w czarnym ugorze po zbiorze plonu;
• uprawa roślin „pułapkowych”, np. rzodkiew lub gorczyca uprawiana w poplonie przywabia larwy mątwika burakowego, ale przed zakończeniem cyklu życiowego nicienia rośliny są przyorywane na zielony nawóz.

W walce biologicznej wykorzystuje się pasożytnicze bakterie lub grzyby. Wszystkie te sposoby są jednak mało efektywne. Współcześnie poszukuje się też genetycznych źródeł odporności na choroby wywoływane przez nicienie u gatunków dzikich i bada się metody ich wprowadzania do odmian uprawnych. Niektóre nicienie pasożytnicze są organizmami kwarantannowymi, w związku czym również w Polsce uchwalono odpowiednie przepisy.  Kwestie te regulowane są poprzez rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. 2004 r. Nr 32 poz. 282) wydane na podstawie art. 10 ust. 1 ustawy z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roślin (Dz. U. z 2004 r. Nr 11, poz. 94). Jest to implementacja dyrektywy 69/465EEC z dnia 8 grudnia 1969 w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się organizmów kwarantannowych, w tym mątwika ziemniaczanego i mątwika agresywnego (Dz. Urz. WE L 323 z 24.12.69 r,).

Sprawcy choroby

Ze względu na prowadzony tryb życia i sposób pasożytnictwa nicienie można podzielić na kilka grup. Migrujące ektopasożyty pozostają na zewnątrz korzenia i pobierają treści z komórek skórki (np. Tylenchorhynchus sp.) lub komórek leżących pod skórką (np. Belonolaimus sp.). Osiadłe ektopasożyty pobierają pokarm przez dłuższy czas tylko z jednego miejsca, ale pozostają na zewnątrz korzenia (np. Criconemella sp. i Hemicycliphora sp.). Migrujące endopasożyty (np. Rotylenchus sp., Pratylenchus sp.) po pobraniu treści komórek rośliny przemieszczają się wewnątrzkomórkowo w poszukiwaniu kolejnego źródła pokarmu. Osiadłe endopasożyty takie jak mątwiki (Heterodera sp. i Globodera sp.) oraz guzaki (Meloidogyne sp.), po znalezieniu odpowiedniego miejsca w korzeniu i indukcji struktury odżywiającej, pozostają nieruchome do końca swojego cyklu życiowego. Prawidłowo funkcjonująca struktura odżywiająca jest jedynym źródłem pokarmu i substancji odżywczych, które wymagane są do osiągnięcia stadium dojrzałego i utrzymania nicienia przy życiu aż przez sześć tygodni od infekcji rośliny. Indukcja i rozwój struktury odżywiającej zakłóca metabolizm komórek rośliny, a tym samym prowadzi nie tylko do zmian morfologicznych i anatomicznych, ale także ultrstrukturalnych większości tkanek gospodarza.

Straty gospodarcze

Największe zagrożenie dla rolnictwa mają mątwiki. Mimo, że mątwiki są pasożytami roślin wielu stref klimatycznych (klimat umiarkowany, subtropikalny i tropikalny), zakres ich gospodarzy jest stosunkowo wąski. Mątwiki powodujące największe straty ekonomiczne to: mątwik ziemniaczany (Globodera rostochiensis) i mątwik agresywny (G. pallida) – szkodniki upraw ziemniaka, mątwik sojowy (Heterodera glycines) porażający soję i mątwik burakowy (H. schachtii) – pasożyt roślin z rodziny szarłatowatych (d. komosowatych), (burak cukrowy, burak pastewny, burak ćwikłowy, kapustowatych (rzepak, kapusta kalafior, brokuły, brukselka) i bobowatych (bób, groch, fasola). Straty plonów powoduje również mątwik zbożowy (H. avenae) pasożytujący na pszenicy, jęczmieniu i owsie.

Badania molekularne

Identyfikacja choroby tylko na podstawie analiz morfologicznych lub/i anatomicznych porażonych roślin jest niewystarczająca. W ciągu ostatnich kilkunastu lat, z wykorzystaniem technik biologii molekularnej, zaczęto opracowywać strategie konstruowania roślin transgenicznych odpornych na nicienie. Jest to przykład innowacyjnego i bardzo obiecującego podejścia do ochrony roślin przed tymi szkodnikami. Niebagatelnym problemem jest prawidłowa identyfikacja gatunku pasożytniczego nicienia. Jest to spowodowane dużym podobieństwem objawów chorobowych wywołanych przez różne gatunki. Mogą pojawiać się również zakażenia mieszane, wywołane jednocześnie przez blisko i daleko spokrewnione gatunki.

Do dokładnej identyfikacji patogenów i szkodników roślin, w tym pasożytniczych nicieni z pomocą przychodzą współczesne techniki badań molekularnych. W przypadku roślin uprawnych istotne jest szybkie działanie, a także jednoznaczna identyfikacja patogenu albo szkodnika. Ogromną przewagą technik biologii molekularnej jest wczesna diagnostyka, często jeszcze przed zaobserwowaniem pierwszych objawów chorobowych. Takie działanie zapobiega wystąpieniu dużych strat w uprawach, a tym samym zmniejsza koszty związane z dalszą walką z patogenem/szkodnikiem. Dokładna i jednoznaczna identyfikacja gatunku patogenu/szkodnika daje nam możliwość odpowiedniego postępowania w odpowiedzi na wystąpienie choroby (np. poprzez dobór odpowiedniego środka ochrony roślin). W tym celu należy zebrać fragmenty (korzenie, łodygi, liście, kwiaty, kwiatostany, owoce) lub całe rośliny i dostarczyć je do laboratorium analiz molekularnych chorób roślin takiego jak  Instytutu Agronomicznego Fertico (IAF). Na wstępnym etapie diagnostyki należy ocenić co, w otrzymanym przez laboratorium materiale roślinnym, może być powodem zmian patologicznych. Innymi słowy z jakim patogenem możemy mieć do czynienia (wirus, bakteria, grzyb, nicień). Zdarza się również, że cała grupa patogenów należących np. do jednego rodzaju (np. w przypadku nicieni z rodzaju Heterodera) powoduje podobne zmiany fitopatologiczne. Często objawy choroby nie są jednoznaczne i trudno jest wskazać konkretny patogen odpowiedzialny za dane zmiany patologiczne. Zdarza się także, że podobne objawy wywoływane są chociażby przez stres abiotyczny (uszkodzenia mechaniczne, warunki środowiska, środki ochrony roślin itd.). W takich przypadkach Klient może poprosić o diagnostykę jednego patogenu bądź kilku prawdopodobnych, wytypowanych przez pracownika laboratorium lub doświadczonego fitopatologa zatrudnionego w IAF. Analiza kilku potencjalnych sprawców choroby daje jednoznaczną odpowiedź jak należy postępować w pracach polowych lub jaki dobrać środek ochrony roślin. IAF wykonuje analizy z wykorzystaniem technik PCR (tradycyjna reakcja PCR, Direct PCR, RT-PCR). Techniki te polegają na namnażaniu materiału genetycznego patogenu i sklasyfikowanie go do konkretnego rodzaju, a nawet gatunku szkodnika. Klasyfikacja opiera się na doborze konkretnych starterów (sekwencji nukleotydów z materiału genetycznego patogenu). Startery są specyficzne dla danego gatunku patogenu, więc otrzymany wynik jest jednoznaczny i wiarygodny. Istotną zaletą analiz molekularnych jest czas. Przy zastosowaniu odpowiedniej procedury odpowiedź można otrzymać nawet tego samego dnia. Interpretacja wyniku jest bardzo prosta. W zmienionym patologicznie materiale roślinnym występuje poszukiwany patogen albo nie.

Obecnie diagnostyka fitopatologiczna z wykorzystaniem technik biologii molekularnej to ważne narzędzie w takich dziedzinach rolnictwa jak: warzywnictwo, sadownictwo a także uprawa roślin ozdobnych.